大豆异黄酮是存在于大豆等豆科植物中的黄酮类化合物，属于植物次生代谢产物。大豆异黄酮以3大类(大豆苷、染料木苷和黄豆黄素苷)，每类又以4种形式(苷元型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型或丙二酰基葡萄糖苷型)存在，因而共包括12种大豆异黄酮(表1)。

　大豆异黄酮是一种天然植物弱雌激素，可以起到类雌激素作用，明显减轻由于更年期热潮而引起的不适应症状(Tham et al., 1998)。研究表明大豆异黄酮在抗癌(Zhang et al., 2008; Dagdemir et al., 2013; Tian et al., 2014)、抗骨质疏松(Om and Shim, 2007; Alekel et al., 2010)、预防心血管病(Sirtori and Lovati, 2001)、提高记忆力(Thorp et al., 2009; Bansal and Parle, 2010)、抗菌消炎(Naim et al., 1974)以及提高机体免疫力等方面具有重要的作用。大豆异黄酮在医药(Kronenberg and Fugh-Berman, 2002)、食品(吴伟等, 2008)、畜牧业(Yuan et al., 2012)等多个行业具有广阔的应用前景，是目前大豆研究的热点之一。

大豆异黄酮含量属于多基因控制的数量性状。不同大豆品种间的大豆异黄酮含量差异很大(孙君明等, 2002)。运用传统的育种方式很难对这类性状进行选择。结合现代分子生物学技术，对大豆异黄酮含量相关的QTL进行定位或对其主效基因进行分子标记，将会极大推动分子标记辅助育种在大豆品质育种上的应用。

本研究以黄酮含量差异显著的‘中豆27’和‘台湾75’为亲本构建大豆高世代重组自交系群体；使用高效液相色谱(HPLC)的方法测定群体12中异黄酮成分的含量；而后使用SSR分子标记对异黄酮含量进行关联分析；以期获得与大豆异黄酮含量紧密相关的分子标记，进而为大豆异黄酮含量相关的分子标记辅助选择奠定基础。

1 结果与分析

1.1 大豆异黄酮含量及其在F_2:6群体中的分布

本研究使用的HPLC检测方法可以清晰地将大豆12种异黄酮成分区分出来(图1)，检测方法稳定可靠。大豆异黄酮12种成分中，A-Genistin、M-Glycitin、Genistein和Daidzein四种成分由于含量较低，部分材料检测值为0，因而未用于统计分析。其它8种(A-Daidzin、A-Glycitin、Daidzin、Genistin、Glycitein、Glycitin、M-Daidzin、M-Genistin)异黄酮成分含量和总异黄酮含量(Total)均呈现明显的单峰分布，表现为典型的数量性状特征(图2)。正态检验结果表明，A-Glycitin、M-Daidzin和总异黄酮含量同时符合正态分布(数据略)。

在160个RIL中，大豆总异黄酮含量单株最高达到5449.9 μg·g^-1，最低值为2191.1 μg·g^-1，平均3467.1 μg·g^-1。8种异黄酮成分中M-Daidzin含量最高，介于770.0和2330.4 μg·g^-1之间，平均1334.0 μg·g^-1；Glycitein含量最低，介于27.6和86.6 μg·g^-1之间，平均仅为53.5 μg·g^-1。

大豆苷、染料木苷和黄豆黄素苷3类异黄酮中，大豆苷类含量最高，单株最高值达到3276.8 μg·g^-1，最低为1108.3 μg·g^-1；染料木苷类含量其次，最高为2086.1 μg·g^-1，最低为889.0 μg·g^-1；黄豆黄素苷类含量最低，平均含量仅为239.2 μg·g^-1。

大豆异黄酮的四种不同存在形式中，丙二酰基葡萄糖苷型含量最高，平均为2426.5 μg·g^-1，占总异黄酮含量的70.26%；其次是葡萄糖苷型，含量为755.6 μg·g^-1，占总异黄酮含量的21.88%；苷元型含量最低，平均53.5 μg·g^-1，仅占总异黄酮含量的1.55%。

1.2 不同异黄酮种类的相关分析

处理A-Genistin、M-Glycitin、Genistein和Daidzein含量低未用于分析外，其它8种异黄酮及总异黄酮含量间的相关分析表明：Glycitein与Glycitin、Daidzin、MDaidzin不相关，A-Daidzin与A-Glycitin、M-Genistin不相关；Glycitin与A-Daidzin含量显著(P＜0.05)正相关；除此之外的所有其它性状之间均表现为极显著(P＜0.01)正相关(表2)。

1.3 SSR分析

从Soybase数据库选择的分布在不同染色体的700个SSR标记中有197个在双亲间表现出明显的多态性，且扩增条带清晰易辨，双亲间SSR标记多态性比例为28.1%。在检测的F_2:6群体中，197个SSR标记的带型均表现为“A”、“B”或者“.”(难于辨识或缺失)，未发现杂合型带型出现。图3为Satt289和Satt565在部分F_2:6群体中的分离情况。

参照Soybase数据库及Song等(2010)的研究结果，双亲间表现多态性的197个SSR标记涵盖了大豆的20个连锁群。其中D1b连锁群标记最多，含19个SSR标记；E连锁群最少，仅包括4个SSR标记(图4)。

1.4异黄酮含量关联SSR标记的分析

使用SAS的Proc GLM命令对F_2:6群体8种异黄酮组分(A-Daidzin; A-Glycitin; Daidzin; Genistin; Glycitein; Glycitin; M-Daidzin; M-Genistin)、总异黄酮含量与对应的SSR标记进行方差分析。结果8种异黄酮组分和总异黄酮含量性状在P＜0.01水平共检测到41个SSR标记与异黄酮含量之间的显著性互作。

与异黄酮含量互作的SSR标记共21个，分布于除A2、D1b、F、H和L连锁群以外的其余15个大豆连锁群，其中B1、C2连锁群上各有3个标记、J连锁群上有2个标记分别与多种异黄酮成分相关(图4)。与A-Daidzin含量互作的SSR标记最少，仅有1个sat_174；与Glycitin含量互作的标记最多，共有11个；与总异黄酮含量相关标记有4个(表3)。 

部分标记同时与多个性状相关，如sat_366与A-Glycitin、Genistin、M-Genistin、Totals相关；标记sat_402与A-Glycitin、Genistin、Glycitin、M-Genistin相关；标记sat_259与A-Glycitin、Daidzin、Genistin、Glycitin、M-Daidzin、M-Genistin、Totals相关等等(图4)。

值得注意的是，有些标记与同一类异黄酮的不同存在形式同时相关。如大豆苷类(Daidzin Group)中，标记sat_174同时与Daidzin和A-Daidzin相关，sat_259同时与Daidzin和M-Daidzin相关。染料木苷类(Genistin Group)中, sat_402、sat_259、sat_366和satt577分别与Genistin和M-Genistin相关。黄豆黄素苷类(Glycitin Group)中的sat_402和sat_259也分别与Glycitin和A-Glycitin相关(表3)。

2 讨论

大豆异黄酮由于具有特定的生理活性而在品种选育过程中备受人们关注。异黄酮各成分均表现为典型的数量性状(图2)，因而传统的育种方式在高异黄酮含量新品种选育过程中难度较大。由于DNA水平的分子标记具有遗传稳定、不受环境影响等优点，如能找到控制异黄酮生物合成的关键基因、QTL或者与异黄酮含量紧密连锁的分子标记，则将会大大促进异黄酮含量相关的品质育种进程，这也是科研工作者的努力方向之一。

本试验使用高效液相色谱方法(Yuan et al., 2009)测定了大豆重组自交系群体12种异黄酮的含量，并对其进行分析。12种异黄酮中，苷元型含量最低，Daidzein和Genistein在许多株系中均未检测到，Glycitein含量也仅占总含量的1.56%，这与相关报道的游离型苷元含量仅占总异黄酮含量的2-3%基本吻合(Kudou et al., 1991; 吴伟等, 2008)。

通过使用197对SSR引物对大豆重组自交系群体的异黄酮含量进行单标记的QTL定位，共找与总异黄酮含量及8种不同异黄酮成分相关的SSR标记21个。在这21个SSR标记中，同一标记与多个异黄酮成分相关的现象非常普遍(表3)，尤其是同一标记同时与同一类异黄酮的不同存在形式相关这一现象非常值得注意。在前人的研究中也可以看到相似的同一标记/QTL/染色体区域对应不同异黄酮性状的研究结果(Akond et al. 2014, Gutierrez-Gonzalez et al., 2009; 2010; 2011; Li et al., 2014; Meksem et al., 2001; Meng et al., 2011; Zeng et al., 2009; Zhang et al., 2014 )。一方面，这种现象可能与不同异黄酮成分含量极显著正相关有关(表2)，另一方面，同一类异黄酮的不同存在形式可以相互转化可能是造成这一结果的原因之一。

参照前人研究结果我们发现，与Glycitin相关的satt197标记与Kassem等(2004)报道相关标记完全一致；与Genistin含量相关的标记satt289与Primomo等(2005)报道的Genistein相关标记以及Gutierrez-Gonzalez等(2010)报道的控制Glycitein含量的QTL吻合；与M-Daidzin相关的Satt155与Primomo等(2005)报道的Genistein相关的标记一致。而部分其它标记，如Glycitein相关的sat_293、Glycitin相关的sat_156、sat_266和satt463，M-Daidzin和Totals相关的sat_156也在文献中找到了遗传距离在5 cM以内的对应QTLs (表3)。这些标记或者标记所在染色体区段在不同的研究中重复出现，可能存在较高的潜在应用价值。

本研究初步确定了与大豆异黄酮含量相关的多个分子标记。由于异黄酮含量除了受本身遗传因素影响外，还会受生长季节、温度、光照等诸多环境因素影响(孙君明和丁安林, 1998; 沈黎明等, 1999; 刘丽君等, 2002; 李卫东等, 2004; 梁慧珍, 2005)，因而对异黄酮含量相关的QTL、分子标记的验证等还需要通过多年多点试验等进行综合研究。

3 材料与方法

3.1 分析群体构建

以异黄酮含量差异显著的‘中豆27’(总异黄酮含量4447 μg·g^-1)和‘台湾75’ (总异黄酮含量2062 μg·g^-1)为亲本进行杂交，后代经杭州(春秋两季)和海南连续加代繁殖，构建了包括160个家系的F_2:6高代重组自交系群体。

3.2 异黄酮提取与含量测定

参照Yuan等(2009)的方法提取和测定大豆异黄酮含量。取0.5 g大豆粉加入含5 mL按3:1(v/v)混合的甲醇：0.1 M盐酸的离心管中，200 rpm振荡提取2 h。吸取2 mL提取混合物至2 mL离心管中，4℃，10000 rpm离心15 min。上清液使用0.45 μm的PTFE膜过滤用于异黄酮含量测定。

使用安捷伦1100系列HPLC系统进行异黄酮含量测定。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×15 0mm，5 μm。流动相A：0.1%的三氟乙酸水溶液(v/v)，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，流速1 mL/min。流动相动态变化设定为(流动相A%/流动相B%)：起始(100/0)，14 min(71/29)，18 min(70/30)，24 min (58/42)，34 min (100/0)。进样量5 μL，柱温37℃，检测波长254 nm。所有异黄酮标样均购自Sigma公司。

3.3 DNA提取与SSR分析

利用CTAB法微量提取大豆基因组DNA，并使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取总DNA的质量。从Soybase数据库中(http://www.soybase.org)选择分布在不同染色体上的700对SSR引物进行多态性筛选，利用条带清晰且在双亲间表现为多态性的引物对重组自交系群体进行扩增。

PCR反应体系：基因组DNA约100 ng，上下游引物各0.3 uM，2× GoTaq Green mix(Promega)5 uL，补充去离子水至总体积为10 uL。为兼顾不同SSR引物退火温度的差异，PCR反应程序设定为：94℃预变性2 min；94℃变性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸45sec，共13个循环，每个循环退火温度降低1℃；然后是94℃变性20sec，47℃退火20sec，72℃延伸45sec，共25个循环；最后72℃延伸5 min，PCR产物4℃保存。

SSR标记对双亲及重组自交系群体的PCR扩增结果使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测，并参照许绍斌等(2002)的方法进行银染和显色。简单来说，聚丙烯酰胺凝胶首先在0.1%的硝酸银(w/v)溶液中振荡染色10 min，然后用自来水冲洗30sec，最后在含0.5%甲醛(v/v)的2%的氢氧化钠(w/v)溶液中振荡显色至条带清晰可辨。

3.4 条带统计

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行条带统计。条带类型表现为亲本1 的记为“A”，表现亲本2 的记为“B”，表现为双亲杂合型的记为“H”，难于辨别的条带或缺失数据记为“.”。

3.5 数据分析

使用SAS for windows v8.1的PROC UNIVARIATE NORMAL命令检测各类异黄酮含量的在RIL群体的分布情况，并使用OriginPro 7.5作图。

使用SAS for windows v8.1的PROC GLM命令进行异黄酮含量相关标记的筛选，以P＜0.01为阈值判断标记与异黄酮含量相关的显著性。使用PROC CORR命令分析不同异黄酮组分之间的相关性。

分子标记的遗传位置参考Song等(2010)研究结果。与异黄酮含量相关SSR标记在连锁图谱上的分布使用MapChart v2.1软件进行绘制。

作者贡献

傅旭军、朱申龙、朱丹华是本研究的实验设计和实验研究的执行人；傅旭军、袁凤杰完成数据分析，论文初稿的写作；杨清华、郁晓敏参与实验设计，试验结果分析；董德坤是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本项目受浙江省旱作粮油科技创新团队项目(2011R50026-18)及农业部转基因生物新品种培育重大专项(2012ZX08009004)共同资助。

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